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饲料中维生素b1的测定




来源:中国养殖网 日期:2008-05-13 作者:
饲料中维生素b1的测定6162008-5-13 9:46:276162008-5-13 9:46:27饲料 616 2008-5-13 9:46:27中国养殖网1主题内容与适用范围
    本标准规定了饲料中维生素b1的测定方法。
    
    本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素b1的测定。萃取液的浓度范围为0.02~0.2μg/ml(在有吸附硫胺素或影响硫色素荧光干扰物质的情况下,本标准不适用)。
    
    2引用标准
    
    gb6682实验室用水规格
    
    3方法原理
    
    试样中的维生素b1(即硫胺素c12h17on4scl)经稀酸消化、酶分解、吸附剂的吸附分离提纯后,在碱性条件下被铁氰化钾氧化生成荧光色素--硫色素,用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的荧光强度与试样中维生素b1的含量成正比,依此进行定量测定。
    
    4试剂和溶液
    
    除特殊规定外,本标准所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水或相应纯度的水。
    
    4.1盐酸溶液,0.1mol/l:将8.5ml盐酸(gb622)用水稀释至1000ml。
    
    4.2硫酸溶液,0.05mol/l:将2.8ml浓硫酸(gb625)加入水中,稀释至1000ml。
    
    4.3乙酸钠溶液,2.0mol/l:取164g无水乙酸钠(gb694)或272g结晶乙酸钠(ch2coona?3h2ogb693)溶于水,稀释至1000ml。
    
    4.4淀粉酶悬浮液,100g/l:用2.0mol/l乙酸钠溶液(4.3)悬浮10g淀粉酶制剂(takadiastase,或相当活性的其他磷酸酯酶),稀释至100ml,使用当日制备。
    
    4.5氯化钾(gb646)溶液,250g/l。
    
    4.6酸性氯化钾溶液:将8.5ml浓盐酸加入至氯化钾溶液(4.5)中,惭稀释至1000ml。
    
    4.7氢氧化钠(gb629)溶液,150g/l。
    
    4.8铁氰化钾(gb644)溶液,10g/l。
    
    4.9碱性铁氰化钾溶液:4.0ml的铁氰化钾溶液(4.8)与氢氧化钠溶液(4.7)混合使之成100ml,此液4h内使用。
    
    4.10冰乙酸(gb676)溶液,30ml/l。
    
    4.11人造沸石(q/hg12-445-63,60~80目)使用前必需活化,方法如下:
    
    将适量人造沸石置于大烧杯中,加入10倍容积的热乙酸溶液(4.10),用玻璃棒均匀搅动10min,使沸石在乙酸溶液中悬浮,待沸石沉降后,弃去上层乙酸液。重复上述操作两次。换用5倍其容积的热氯化钾溶液(4.5)搅动清洗两次,每次15min。再用热乙酸溶液洗10min。最后用热蒸馏水清洗沸石至无氯离子(用10g/l硝酸银水溶液检验)。用布氏漏斗抽滤,100℃烘干,贮于磨口瓶中备用。使用前,检查沸石对硫胺素标准溶液的回收率,如达不到92%,需重新活化沸石。
    
    4.12硫胺素标准溶液
    
    4.12.1硫胺素贮备液?:盐酸硫胺素纯品(中国药典参照标准),于五氧化二磷干燥器24h,称取0.0500g,溶解于ph4.5~4.3的20%(v/v)乙醇溶液中并定容至500ml,盛于棕色瓶中低温保存。该溶液每毫升含0.1mg硫胺素。
    
    4.12.2硫胺素贮备液?:取硫胺素贮备液?(4.12.1)10ml用酸性20%乙醇溶液定容至100ml,盛于棕色瓶中低温保存。该溶液每毫升中含10μg硫胺素。
    
    4.12.3硫胺素标准工作液:取贮备液?(4.12.2)2ml与65ml盐酸溶液(4.1)和5ml乙酸钠溶液(4.3)混合,用水定容至100ml。现用现配。该溶液每毫升中含0.2μg硫胺素。
    
    4.13硫酸奎宁(q/hg22-797-68)溶液
    
    4.13.1硫酸奎宁贮备液:称取硫酸奎宁0.1000g,用0.05mol/l硫酸(4.2)溶解并定容至1000ml,贮于棕色瓶中低温保存。若溶液混浊则需重新配制。该溶液每毫升中含0.1mg硫酸奎宁。
    
    4.13.2硫酸奎宁工作液:取贮备液(4.13.1)3ml,用0.05mol/l硫酸定容至1000ml,盛于棕色瓶中,低温保存。该溶液每毫升中含0.3μg硫酸奎宁。
    
    4.14正丁醇(hg3-1012),其荧光强度不超过硫酸奎宁工作液的4%,否则需用全玻璃蒸馏器重蒸馏,取114℃~118℃馏份。
    
    4.15无水硫酸钠(hg3-123)。
    
    5仪器、设备
    
    5.1荧光分光光度计,备1cm石英比色杯。
    
    5.2电热恒温水浴。
    
    5.3电热恒温箱。
    
    5.4实验室用样品粉碎机。
    
    5.5分析天平:感量0.0001g。
    
    5.6注射器:10ml。
    
    5.7吸附分离柱:全长235mm,外径×长度如下:
    
    上端贮液槽容量约为50ml,35mm×70mm;中部吸附管8mm×130mm;下端35mm;下端35mm拉成毛细管。
    
    5.8反应瓶:具塞离心管25ml。
    
    6试样的制备
    
    选取有代表性的饲料样品,至少500g,四分法缩减至100g,磨碎,过0.28mm孔筛,混匀,装入密闭容器中,避光低温保存备用。
    
    7分析步骤
    
    7.1称样:称取单一饲料、配合饲料或浓缩饲料1~2g(约含硫胺素4~20μg),精确至0.001g。维生素预混料0.25~0.5g,精确至0.0001g,置于100ml容量瓶中。
    
    7.2提取
    
    7.2.1水解:将0.1mol/l盐酸(4.1)65ml加入试样瓶(7.1)中,经沸水浴加热30min,开始加热5~10min内不时摇动容量瓶,以防结块。或于121℃~123℃15磅高压釜中加热30min。
    
    7.2.2酶解:冷却容量瓶至50℃以下,加5ml淀粉酶悬浮液(4.4),摇匀。该试液的ph约为4.0~4.5,将容量瓶于45℃~50℃恒温箱中保温3h,取出冷却调整ph4.5,用水稀释至100ml。
    
    7.2.3过滤:将试液通过无灰滤纸过滤弃去初滤液5ml,收集滤液于锥形瓶中。预混料提取液需逐级稀释,使之含硫胺素约为0.2μg/ml。
    
    7.3提纯
    
    7.3.1制备吸附柱:取1.5g活化人造沸石(4.11)置于50ml小烧杯中,加入3%乙酸溶液(4.10)浸泡。将脱脂棉置于吸附柱底部,用玻璃棒轻压。然后将乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中(勿使吸附柱脱水),过柱流速≤1ml/min为宜。再用10ml近沸的洗柱一次。
    
    7.3.2吸25ml提取液(7.2.3),慢慢加入制备好的吸附柱中,弃去滤液,用每份5ml近沸的水洗柱三次,弃去洗液。
    
    7.3.3用25ml60℃~70℃酸性氯化钾(4.6)分三次连续加入吸附柱,收集洗脱液于25ml容量瓶中,冷却后用酸性氯化钾定容,混匀。
    
    7.3.4同时用25ml硫胺素标准工作液(4.12.3)。重复7.3.1~7.3.3操作,作为外标。
    
    7.4氧化与萃取(以下操作避免紫外光照射)
    
    7.4.1于两只反应管中各吸入5ml洗脱液(7.3.3),记作a、b。
    
    7.4.2向b管加3ml氢氧化钠溶液(4.7),再向a管中加3ml氧化剂碱性铁氰化钾溶液(4.9),轻轻旋摇。依次立即向a管加15ml正丁醇加塞,剧烈地振摇15s,再向b管加入15ml正丁醇加塞。共同振摇90s,静置分层。
    
    7.4.3用注射器吸去下层水相,向各反应管加入约2g无水硫酸钠(4.15),旋摇,待测。
    
    7.4.4同时将5ml作为外标的洗脱液(7.3.4),置入另两只反应管,相应地记作c、d,按7.4.1~7.4.3操作。
    
    7.5测定
    
    7.5.1用硫酸奎宁工作液(4.13.2)调整荧光仪,使其稳定于一定数值,作为仪器工作的固定条件。
    
    7.5.2于激发波长365nm,发射波长435nm处测定各反应管中萃取液[(7.4.3)和(7.4.4)]的荧光强度。
    
    8分析结果的计算和表述
    
    8.1计算公式
    
    硫胺素(维生素b1)含量以mg/kg(或g/kg)表示,按下式计算:
    
    硫胺素(vb1mg/kg)=〔(t-t0)/(s-s0)〕×c×(v2/v1)×(v0/m)
    
    式中:t──a管试液的荧光强度;t0──b管试液空白的荧光强度;s──c管标准溶液的荧光强度;s0──d管标准溶液空白的荧光强度;c──硫胺素标准工作液浓度,μg/ml;0──提取液总体积,ml;v1──分取提取液过柱的体积,ml;v2──酸性氯化钾洗脱液体积,ml;m──试样质量,g。
    
    8.2平行测定结果用算术平均值表示,保留有效数3位。
    
    9重复性
    
    同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定,所得结果之间的差值;在硫胺素含量小于或等于5.0mg/kg时,不得超过平均值的15%。在硫胺素含量大于5.0mg/kg时,不得超过平均值的10%。在硫胺素含量大于50mg/kg时不得超过平均值的5%。