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猪肉中青霉素残留量检测方法-酶联免疫吸附测定(ELISA)法




来源:四川畜牧食品信息网 日期:2009-05-12 作者:
猪肉中青霉素残留量检测方法-酶联免疫吸附测定(ELISA)法6162009-5-12 10:10:186162009-5-12 10:12:34猪;猪肉;免疫;检测;残留;法 616 2009-5-12 10:10:18四川畜牧食品信息网

为了加强食品安全检测,保障人民群众的身体健康和生命安全,有效监测猪肉中的青霉素残留,我们建立了《猪肉中青霉素残留检测方法—酶联免疫吸附测定法(ELISA)法》。
本标准按GB/T1.1—2000 《标准的结构和编写规则》进行编制,GB/T 1.2-2000《标准化工作导则 第2部分:标准中规范性技术要素内容的确定方法》进行修改。
本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。
本标准由四川省质量技术监督局批准发布。
本标准起草单位:四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所。
本标准主要起草人:杨松沛、彭莉、岳秀英、熊浩山、官艳丽、王海波、吴晓岚。

猪肉中青霉素残留量检测方法-
酶联免疫吸附测定(ELISA)法
本标准规定了猪肉中青霉素残留量检测的制样和酶联免疫吸附测定法。
本标准适用于猪肉中青霉素的残留量的快速筛选检测。本方法在猪肉中的最低检出限为4.0μg/ Kg。对于可疑样品需用确证法确认。
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682-1992 分析实验室用水规则和试验方法
取适量新鲜的空白或供试猪肉,绞碎匀浆使之均匀,密封。
-20℃以下冰箱中贮存备用。
猪肉中残留的青霉素用乙腈- 0.1M NaOH溶液提取,酶联免疫吸附测定法测定,其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原,标样或样品中的青霉素与酶标记抗原竞争青霉素特异性抗体。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标记抗原。加入底物液,结合到板上的酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液,在450nm处测定吸光度值,吸光度值与试样中青霉素浓度呈反比。
以下所用的试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T 6682规定的二级水。
4.2.1 0.1M NaOH溶液:称取0.4gNaOH,加入去离子水100mL溶解。
4.2.2 乙腈- 0.1M NaOH溶液的配制:取乙腈84mL,加入0.1M NaOH溶液16mL混合均匀。
4.2.3 青霉素试剂盒(采用官方备案的试剂盒)
4.2.3.1 青霉素系列标准溶液  0mg/mL 、0.1mg/mL、0.3mg/ml、0.9mg/mL、2.7mg/mL、8.1mg/mL
4.2.3.2 酶标板  8条×12孔,包被有偶联抗原
4.2.3.3 酶标记物
4.2.3.4 青霉素抗体
4.2.3.5 底物溶液A
4.2.3.6 底物溶液B
4.2.3.7 浓缩洗涤液临用前用水稀释二十倍作为洗涤液
4.2.3.8 终止溶液
4.3.1 酶标仪(配备450nm滤光片)
4.3.2 天平 感量0.01g
4.3.3 分析天平 感量0.00001g
4.3.4 漩涡混合器
4.3.5 振荡器
4.3.6 组织匀浆机
4.3.7 冷冻离心机
4.3.8 氮吹仪
4.3.9 离心管 20mL
4.3.10 微量移液器  单道20mL,50mL,100mL,1000mL;多道50~250mL
4.4.1 试料的制备
试料的制备包括:
——取混匀后的供试样品,作为供试试料。
——取混匀后的空白样品,作为空白试料。
——取混匀后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试料。
4.4.2 提取和净化
精密称取2g试料于离心管中,加入8mL乙腈- 0.1M NaOH溶液(V/V 84:16),涡旋2 min,振荡20min,室温6000r /min离心10min,取出1mL上层液体在氮气流下50~60℃干燥,加入1mL正己烷溶解干燥的残留物,再加1mL稀释后的复溶液充分混匀,室温6000r /min离心5min,去除上层正己烷相,下层水相按1:4体积比进行稀释(50mL样本液+200mL稀释后的复溶液),取50mL用于分析。
4.4.3 样品测定程序(20℃~26℃条件下操作)
4.4.3.1 使用前将试剂盒置于室温(20℃~26℃)平衡30min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中,将不用的微孔条放入自封袋,保存于2℃~8℃。将样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品均需做两个平行实验。
4.4.3.2 加入50 mL标准溶液或试样溶液到微孔底部,每孔再加入50mL青霉素抗体溶液,轻轻振荡混匀,用盖板膜封板,37℃环境中反应30min。
4.4.3.3 倒出孔中液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,去除孔中液体。每孔加入250mL洗涤液,10s后倒出孔中液体,用吸水纸拍干,如此重复操作共洗板5次。
4.4.3.4 加入100mL酶标记物到微孔底部,用盖板膜封板,37℃环境中反应30min。取出酶标板,如前述洗板5次。
4.4.3.5 加入50mL底物溶液A和50mL底物溶液B到微孔中,轻轻振荡混匀37℃环境避光显色15min。
4.4.3.6 加入50mL终止液到微孔中,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处,测定每孔吸光度值(OD值)。

B
——
B0
 
所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值的平均值再乘以100%,得到以百分比给出的吸光度值,以式(1.1)表示:

 
百分吸光度值=      ×100% …………………………………………………1.1 
式中:
B—为标准溶液或供试样品的平均吸光度值;
B0为零浓度标准溶液的平均吸光度值。
X轴为标准溶液中青霉素浓度(mg/L)的自然对数,Y轴为百分吸光度值,在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。相对应的供试样品的浓度(mg/L)可以从标准曲线上查出。也可以求出回归曲线的方程,计算未知样品中青霉素的浓度。如果有专业计算机软件可直接求出供试样中青霉素的浓度。
注:检测结果小于50μg/Kg时,可判为符合规定,大于50μg/Kg时,判为可疑,需用确证法确认。
本方法在猪肉中的最低检测限为1.0μg/Kg,最低检出限为4.0μg/ Kg
本方法在猪肉中4.0μg/Kg~50.0μg/Kg添加浓度的回收率为60.0%~120.0%。
本方法的批内变异系数CV≤21%;批间变异系数CV≤32%。