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磺胺类药物多残留酶联免疫试剂盒质量标准




来源:中国兽医药品监察所 日期:2011-07-21 作者:
磺胺类药物多残留酶联免疫试剂盒质量标准6162011/7/20 14:59:276162011/7/20 14:59:27标准;免疫;残留 616 2011/7/20 14:59:27中国兽医药品监察所

   本品系用磺胺类药物(SAs)偶联的抗原、SAs单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测鸡组织、鸡蛋、尿、蜂蜜等样本中磺胺类药物的残留量。

【物理性状】试剂盒外观完整,内装试剂齐全。包被抗原的酶标板透明、干燥且用真空包装,磺胺类药物(SAs)抗体工作液、底物液、终止液、标准品溶液、浓缩洗涤液、浓缩提取液为透明溶液,酶标记物为浅黄色溶液。试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】 取已包被好的酶标板12孔,每两孔分别加入0?g/L1?g/L3?g/L9?g/L27?g/L81?g/L标准溶液各20?L,然后加入酶标记物各50?L,再加入SAs 抗体工作液各80?L,用盖板膜盖板,25反应1h,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50?L,避光25反应2030min,用50?L终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值(B)平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以SAs浓度(?g/L)的自然对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。

IC50(即0浓度标准溶液的吸光度值50%处所对应的SAs浓度)范围应在1.64?g/L ~3.54?g/L之间。

【特异性测定】 取已包被好的酶标板18孔,每两孔分别加入0?g/L1?g/L3?g/L9?g/L27?g/L81?g/L标准溶液和阴性鸡肉样本提取液、50?g/kg 100?g/kg 磺胺二甲基嘧啶添加的阳性鸡肉组织样本提取液各20?L,加入酶标物50?L,再加入SAs抗体工作液80?L 25反应1h,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50?L,避光25反应2030 min,用50?L终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值平均值(B)除以第一个标准(0标准)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以SAs浓度(?g/L)的自然对数为X轴,百分吸光度为Y轴,绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和50?g/kg100?g/kg 磺胺二甲基嘧啶添加的鸡肉组织样品的测定浓度。

阴性样品测定值在2?g/kg以下,50?g/kg 100?g/kg两个浓度磺胺二甲基嘧啶添加回收率在65.0%120.0%之间。  

  【精密度测定】 取已包被好的酶标板32孔,每两孔分别加入0?g/L1?g/L3?g/L9?g/L27?g/L81?g/L标准溶液20?L,其它20孔加入9?g/L的标准溶液20?L,再加入酶标物50?L,再加入SAs 抗体工作液80?L25反应1h,取出洗板5次,拍干。加入底物液各50?L,避光25反应2030 min,用50?L终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的9?g/L标准溶液的吸光度值变异系数(%)应25%n=20)。

【适用范围】 用于定量、定性检测鸡组织(肌肉、肝脏等)、鸡蛋、蜂蜜、尿液等样品中磺胺类药物的残留量。

【用法和结果判定】

1. 溶液的配制

1.1 2M NaCL溶液:称取11.69gNaCL  加入100mL水溶解。

1.2 稀释提取液:20X浓缩提取液摇匀,用水以120的比例稀释,临用前配制。

1.3 稀释洗涤液:20X浓缩洗涤液摇匀,用水以120的比例稀释,临用前配制。

2. 样本前处理

2.1 鸡组织(肌肉、肝脏等)样本处理方法

2.1.1 取适量鸡组织,用匀浆机10000r/min匀浆1 min,称取5±0.05g匀浆物置离心管中,加入15mL乙腈-水溶液(84+16v/v)混合,剧烈振荡10min。于153000g以上速度离心10min

2.1.2 3mL上清液,加入2mL水和5mL乙酸乙酯,混合振荡10min153000g以上速度离心5min

2.1.3 将上层液移另一管中用氮气吹干(或鸡心瓶中,50减压蒸干)。

2.1.4 用异辛烷或正己烷1mL溶解干燥的残留物,加入稀释了的提取液1mL振荡2min153000g,离心5min,除去上层液。

2.1.5 20μL水相进行分析。

2.2  鸡蛋样本处理方法

样本处理方法同动物组织处理方法。

2.3  蜂蜜样本处理方法

称取1g蜂蜜样本于50mL离心管中,加入2mL PB缓冲液,再加入8mL乙酸乙酯,振荡萃取10min3000g以上离心10min,取上层液体于50下氮气吹干,加1mL稀释了的提取液复溶,取20mL进行分析。

2.4 尿液样本处理方法

2.4.12mL尿液,加入8mL乙酸乙酯,震荡萃取10min3000g以上离心10min,取上层液4mL,于50下氮气吹干,加1mL稀释了的提取液复溶。

2.4.2 20μL进行分析

3. 检测步骤

3.1 将所需试剂从冷藏环境中取出,置室温(20~24℃)平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 按需要取出微孔条及板架,将不用的微孔放入自封袋,保存于2-8℃

3.3 编号:将样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品均需做2孔。

3.4 反应:往酶标板微孔中加标准溶液或样本溶液20?L,加酶标记物50?L,然后加入磺胺类抗体工作液80 ?L,用盖板膜封板,25恒温箱中反应1h。倒出孔中液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,去除孔中液体。每孔加入250?L洗涤液,30秒后倒出孔中液体,用吸水纸拍干,如此重复操作共洗板5次。

3.5 显色:每孔加入AB底物液各50?L,轻轻振荡混匀,25恒温箱避光显色20~30min

3.6 测定:每孔加入终止液50mL,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测),测定吸光度值(OD值)。

4. 结果判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。

 

B

 

百分吸光度值(%)=

×100%

 

B0

 

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B00?g/L标准溶液的平均吸光度值

以磺胺药物浓度的自然对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法,计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件,更便于大量样品的快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存,保存期为6个月。

【规格】 每个试剂盒含96孔板一块;标准品溶液6瓶,1mL/瓶(0?g/L1?g/L3?g/L9?g/L27?g/L 81?g/L);SAs抗体工作液1瓶,10mL;酶标二抗工作液1瓶,7mL20倍浓缩洗涤液1瓶,40mL20倍浓缩提取液1瓶,50 mL;底物液A1瓶,7mL;底物液B1瓶,7mL;终止液1瓶,7mL;高浓度标准品(1?g/mL1瓶,1mL;盖板膜1张;自封袋1个;说明书1份;质量报告1份。

【注意事项】

1、试剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌,防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证,合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

 5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象,则视该批试剂盒为不合格。