当前位置:首页 > 畜产品质量安全
氟喹诺酮类药物酶联免疫试剂盒质量标准




来源:中国兽医药品监察所 日期:2011-07-21 作者:
氟喹诺酮类药物酶联免疫试剂盒质量标准6162011/7/20 15:00:556162011/7/20 15:00:55标准;免疫 616 2011/7/20 15:00:55中国兽医药品监察所

   本品系用氟喹诺酮类药物(QNS)偶联蛋白成为抗原、氟喹诺酮类药物类单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测鸡组织、虾、血清等样本中氟喹诺酮类药物的残留量。

【物理性状】 试剂盒外观完整,内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装,氟喹诺酮类药物(QNS)抗体工作液、标准品溶液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液为透明溶液,酶标记物为浅黄色溶液,试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】 取已包被好的酶标板12孔,每两孔分别加入0?g/L1?g/L3?g/L9?g/L27?g/L81?g/L标准溶液各50?L,然后加抗体工作液50 mL/孔,用盖板膜盖板,37环境中反应30min,取出用洗涤液按每孔250μL,洗板45次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干,加酶标物每孔100mL,用盖板膜盖板37环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL,洗板45次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干。每孔加入底物液A50mL,再加B50mL,轻轻振荡混匀,37环境避光显色15min。用50?L终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。每个浓度标准溶液吸光度值(B)平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以环丙沙星浓度(?g/L)的自然对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。

IC50(即0浓度标准溶液的吸光度值50%处所对应的环丙沙星浓度)范围应在3.93?g/L ~5.49?g/L之间。

【特异性测定】 取已包被好的酶标板18孔,每两孔分别加入0?g/L1?g/L3?g/L9?g/L27?g/L81?g/L标准溶液和阴性鸡肉样本提取液、20?g/kg50?g/kg 两个浓度环丙沙星添加的阳性鸡肉样本提取液各50?L,然后加抗体工作液50 mL/孔,用盖板膜盖板,37环境中反应30min,取出用洗涤液按每孔250μL,洗板45次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干。加酶标记物每孔100mL,用盖板膜盖板后置37环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL,洗板45次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干。每孔加入底物液A50mL,再加B50mL,轻轻振荡混匀,37环境避光显色15min。用50?L终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。每个浓度标准溶液吸光度值(B)平均值除以第一个标准(0标准)吸光度值(B0)的平均值再乘以100%,即百分吸光度值。以环丙沙星浓度(?g/L)的自然对数为X轴,百分吸光度为Y轴,绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和20?g/kg50?g/kg 环丙沙星添加的组织样品的测定浓度。

阴性样品测定值在4?g/kg以下,按20?g/kg 50?g/kg 两个浓度分别将环丙沙星对鸡肉、鸡肝、虾、血清进行添加,回收率应在50.0%~130.0%之间。

【精密度测定】 取已包被好的酶标板32孔,每两孔分别加入0?g/L1?g/L3?g/L9?g/L27?g/L81?g/L标准溶液50?L,其它20孔加入9?g/L的标准溶液50?L,,然后加抗体工作液50 mL,用盖板膜盖板,37环境中反应30min,取出用洗涤液按每孔250μL,洗板4~5次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干。加酶标物每孔100mL,用盖板膜盖板后置37环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL,洗板45次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干。每孔加入底物液A50mL,再加B50mL,轻轻振荡混匀,37环境避光显色15min。用50?L终止液终止反应,置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的9?g/L标准溶液的光吸收值变异系数(%)应25%n=20

【适用范围】 用于定量、定性检测鸡组织(肌肉、肝脏等)、虾、血清等样本中氟喹诺酮类药物的残留量。

【用法和结果判定】

1.溶液配制:

1.1 PB溶液的配制:称取磷酸氢二钠2.58g磷酸二氢钠0.44g溶于500ml去离子水中。

1.2 稀释浓缩复溶液:将2X浓缩复溶液摇匀,用水以12的比例稀释,临用前配制。

1.3 稀释浓缩洗涤液:将20X浓缩洗涤液摇匀,用水以120比例稀释,临用前配制。

2.  样品前处理

2.1  鸡组织(肌肉、肝脏等)、虾样本处理方法

2.1.12.0g均质过的组织样本于50mL离心管中。

2.1.2加入乙腈NaOH溶液10mL。充分混合10min3000g以上,15离心10min

2.1.3取上层液5mL,加入5mLPB缓冲液,再加入正己烷4mL,混合2min3000g以上,15离心10min,除去上层有机相。

2.1.4加入二氯甲烷8mL,充分混匀10min3000g以上,15℃离心10min。去上层,取下层有机相移到干燥瓶中(清亮无杂质),50旋转蒸发至干或用氮气吹干。

2.1.50.6mL稀释了的复溶液溶解干燥的残留物,加入正己烷1mL混合2min,取出3000g以上,15离心5min

2.1.6轻吸掉上层有机相和中间部份液体,取下层50mL+50mL稀释了的复溶液混匀即可分析。

2.2  鸡血样本处理方法

2.2.1 用加有肝素钠(20~30单位/mL血)的离心管采集鸡血样本(采血注射器也用肝素钠润洗),血样本室温静置1h,待析出血浆后3000g以上,15离心10min,取出血浆/血清1mL

2.2.2 加入乙腈4mL充分混合10min3000g以上,15离心10min

2.2.3 移上清至另一离心管中,加入2mL PB缓冲液,混匀。

2.2.4 加入二氯甲烷5mL,充分混匀10min3000g以上, 15离心10min。去上层,取下层有机相到干燥瓶中(清亮无杂质),50旋转蒸发至干或用氮气吹干。

2.2.5 0.6mL 稀释了的复溶液溶解干燥的残留物,加入正己烷1mL混合2min,取出3000g以上,15离心5min

2.2.6 轻吸掉上层有机相和中间白色杂质,取下层50mL50mL稀释了的复溶液混匀即可分析。

3.  检测步骤

3.1 将所需试剂从冷藏环境中取出,置室温(20~24℃)平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 按需要取出微孔条及板架,将不用的微孔条重新密封,保存于2~8℃

3.3 编号:将样品和标准品对应微孔按序编号,每个样品和标准品均需做2孔。

3.4 加标准品或样本50mL,然后各加入抗体工作液50mL,用盖板膜盖板,37环境中反应30min

3.5 取出用稀释后的洗涤液按每孔250μL,洗板4~5次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干。

3.6 加酶标记物,每孔100mL,用盖板膜盖板后置37环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL,洗板4~5次,每次浸泡10秒,用吸水纸拍干。

3.7 显色:每孔加入底物液A50mL,再加B50mL,轻轻振荡混匀,37环境避光显色15min

3.8 测定:每孔加入终止液50mL,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测),测定吸光度值(OD值)。

4结果判定 

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。

 

B

 

百分吸光度值(%)=

×100%

 

B0

 

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L标准溶液的平均吸光度值

以环丙沙星浓度的自然对数值为X轴,百分吸光度值为Y轴,绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法,计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件,更便于大量样品的快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存,保存期为6个月。

【规格】 每个试剂盒含96孔板一块;环丙沙星标准品6瓶,1mL/瓶(0?g/L1?g/L3?g/L9?g/L27?g/L 81?g/L);QNS抗体工作液1瓶,10mL;酶标记工作液1瓶,12mL20倍浓缩洗涤液1瓶,40mL2X浓缩复溶液1瓶,50ml;底物液A1瓶,7mL;底物液B1瓶,7mL;终止液1瓶,7mL;高浓度标准品(1?g/mL1瓶,1mL;盖板膜1张;自封袋1个;说明书1份;质量报告1份。

【注意事项】

1、试剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌,防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证,合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象,则视该批试剂盒为不合格。