病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，谓之中和试验。本试验主要用于：①从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病；②用抗毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型；③测定抗病毒血清或抗毒素效价；④新分离病毒的鉴定和分型，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。试验方法主要有简单定性试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法等。
（一）简单定性中和试验
本法主要用于检出病料中的病毒，亦可进行初步鉴定或定型。先根据病毒易感性选定试验动物（或鸡胚、细胞培养）及接种途径。将病料研磨，并稀释成一定浓度（约100 LD50～1 000LD50或TCID50）。污染的病料需加抗生素（青霉素、链霉素各200～1 000单位），或用细菌滤器过滤，与已知的抗血清（适当稀释或不稀释）等量混合，并用正常血清加稀释病料作对照。混合后置37℃1h，分别接种实验动物，每组至少3只。分别隔离饲喂，观察发病和死亡情况。对照动物死亡，而中和组动物不死，即证实该病料中含有与该抗血清相应的病毒。本法亦可用于毒素（如肉毒毒素）的鉴定和分型。
（二）固定血清稀释病毒法
本法多将病毒作10倍递增稀释，分置2列试管，第一列加正常血清（对照组），第二列加待检血清（试验组）。混合后，置37℃作用1h，将各管混合液分别接种选定的试验动物，每一稀释度用3～5只动物。接种后，逐日观察，并记录其死亡数，观察结束后，计算LD50和中和指数（表7-1、表7-2），本法适用于大量检样的检测。
表7-1 固定血清稀释病毒法术式
混合前 病毒稀释 | 2×10-1 | 2×10-2 | 2×10-3 | 2×10-4 | 2×10-5 | 2×10-6 | 2×10-7 | - |
正常 血清 | 稀释病毒 | - | - | - | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | - |
正常血清 | - | - | - | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
对照组 | 稀释液 | - | - | - | - | - | - | - | 1.0 |
待检血清 | 稀释病毒 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | - |
待检血清 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
中和组 | 稀释液 | - | - | - | - | - | - | - | 1.0 |
混合后病 毒稀释 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | - |
表7-2固定血清稀释病毒法中和试验（例一）
病毒稀释 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | LD50［2］ | 中和指数 |
正常血清对照组 | - | - | - | 4／4［1］ | 3／4 | 1／4 | 0／4 | 10-5.5 | 103.3＝1.995 |
待检血清中和组 | 4／4 | 2／4 | 1／4 | 0／4 | 0／4 | 0／4 | 0／4 | 10-2.2 |
注：［1］分母为接种数，分子为死亡数；
［2］LD50计算见实例。
中和指数＝中和组LD50/对照组LD50=10-2.2/10-5.5=103.3
查3.3反对数是1.995，故中和指数103.3＝1.995。也就是说该待检血清中和病毒的能力为正常血清的1.995倍。本法多用以检出待检血清中的中和抗体，对病毒而言，通常中和指数大于50者判为阳性，10～49为可疑，小于10为阴性。
（三）固定病毒稀释血清法
本法用以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液（与血清混合后，每一接种剂量含病毒100LD50），摇匀后，置37℃作用1h，接种实验动物（表7-3）。
表7-3 固定病毒稀释血清中和试验(例二)[1]
血清稀释度[2] 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 - 血清中和价（PD50）[4] |
正常血清 0/4[3] - - - - - - - - - - 康复血清 4/4 4/4 4/4 3/4 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1:141 免疫血清 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 1:1280 |
注：[1] 接种剂量0.1ml，含病毒100LD50；
[2] 系指与病毒混合后的稀释度；
[3] 分母为接种数，分子为保护数；
[4] PD50为半数保护，其计算法同LD50的计算。
（四）空斑减少法
在细胞培养上进行病毒中和试验，近年来多采用空斑减少法。先将病毒稀释成适当浓度，使每0.2ml含80个～100个PFU（空斑形成单位），与不同稀释度的待检血清等量混合，置37℃作用1h～2h，分别测定PFU，使空斑减少50％血清稀释度即为该血清的中和价。见表7-4。
表7-4 空斑减少法中和试验示例
血清稀 释倍数[1] | 1:16 (4-2) | 1:64 (4-3) | 1:256 (4-4) | 1:1024 (4-5) | 1:409 (4-6) | 不加 血清 对照 | 中和抗 体价[2] |
待检血清A | 空斑数 | 3 | 13 | 38 | 51 | 53 | 55 | 4-3.6=1:140 |
空斑减少率 | 95％ | 76％ | 31％ | 7％ | 0％ |
待检血清B | 空斑数 | － | 8 | 25 | 51 | 56 | 55 | 4-4.1=1:290 |
空斑减率数 | － | 85％ | 54％ | 7％ | 0％ |
待检血清C | 空斑数 | － | － | 6 | 22 | 44 | 55 | 4-5.2=1:1300 |
空斑减少率 | － | － | 89％ | 59％ | 19％ |
注：[1] 血清用4倍递增稀释；
[2] 空斑减少50％的血清稀释度，其计算法同LD50的计算。